Røntgenkrystallografi

Ansvarlig: Professor Hans E. Krokan
Kontaktperson og ansvarlig for daglig drift: Davi Fonseca

 

 

Om laboratoriet Røntgenkrystallografilaboratoriet er lokalisert i Laboratoriesenteret, 4. etasje øst, på St. Olav. Utstyr for opptak av røntgenkrystallografi data ble finansiert i 2005 og anskaffet løpet av våren 2006. Driften er finansiert av prosjekter innen Forskningsgruppen for DNA reparasjon og genomstabilitet. Det er muligheter for å samle røntgendata fra krystaller av makromolekyler og småmolekyler.

 

Utstyr
Pr. vår 2007 disponerer laboratoriet følgende instrumenter:

Røntgendiffraktometer
Xcalibur Nova: Oxford Diffraction
- 165 mm ONYX CCD detector
- Nova micro-focus X-ray source (Cu)
- 4-circle kappa platform
- CrysAlis pro (data collection software)

Kryokjøling
Cryojet XL: Oxford Diffraction
- Temperature range 90-300 K
- 200 L autofill tank

Mikroskop
Discovery v12: Zeiss

Lavtrykks-LC-utstyr for proteinseparasjon
FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography)
- Äkta Explorer: GE Healthcare
- Äkta FPLC: GE Healtcare

Spektrofotometere
- Nanodrop ND-1000
- Qubit fluorometer: Invitrogen
- PharmaSpec UV-1700: Shimadzu

Geldokumentasjon (inkl. Western analyse)
- Kodak 4000R: Kodak
- Typhon Trio: GE Healthcare

Annet utstyr og fasiliteter i tilstøtende lokaler ved IKM
- Proteomikklaboriatoriet
- Konfokallaboriatoriet (inkl FACS)
- PCR maskiner
- Ryste inkubatorer
- Sentrifuger
- Ultrasentrifugeradientmaker/fraksjoneringsutstyr
- Beta-scintillisjonsteller
- Med mer.

Røntgenkrystallografistudier innen DNA-reparasjon
For å sikre stabiliteten av det humane genomet har cellene egne DNA-reparasjonsproteiner som kan gjenkjenne og reparere ulike skader i DNA. Ulike skader repareres av ulike reparasjonsspor, og i hvert spor samarbeider bestemte proteiner om å fullføre reparasjonen. Forståelsen for de grunnleggende molekylære mekanismene som sikrer integriteten til DNA basene er fundamental for å løse viktige vitenskapelige og medisinske spørsmål, herunder ligger evaluering av risiko knyttet til arvelig defekt i reparasjonsspor, miljøgifter og medisinsk behandling. DNA-reparasjon er vital for alle levende organismer. Skader som ikke blir oppdaget og fullstendig reparert før replikasjon kan medføre mutasjoner i viktige gener som i sin tur kan medføre sykdommer som f.eks kreft.

Strukturbiologi er en viktig del for å øke forståelsen for hvordan reparasjonsproteiner gjenkjenner skader i DNA og hvordan disse skadene blir reparert, og i tillegg på hvilken måte mutasjoner/feil i enkelte proteiner kan medføre svikt i reparasjonsspor (Huffman et al., 2005 ).

Forskningsgruppen for DNA reparasjon og genomstabilitet har i en årrekke hatt et tett samarbeid med Professor John A. Tainer ved The Scripps Research Institute, La Jolla, USA innen protein struktur/funksjonsstudier. Flere medarbeidere ved IKM har tilbragt lengre forskningsopphold i Tainers gruppe og arbeidet med praktisk røntgenkrystallografi av blant annet uracil-DNA glykosylase UNG. UNG er et enzym som gjenkjenner potensielt mutagent uracil i DNA og fjerner denne som første trinn i base-eksisjon-reparasjons (BER) sporet. Det humane UNG2-enzymet består et N-terminalt regulatorisk domene og et C-terminalt katalytisk domene.

I samarbeid med Professor Tainer og kollegaer ble strukturen til det katalytiske domenet av human UNG2 løst ved røntgenkrystallografi og publisert i Cell i 1995 (Mol et al., 1995 ). Dette var det første humane reparasjonproteinet som ble strukturoppklart. Ut i fra røntgenstrukturen av UNG bundet til 6-aminouracil sammen med mutasjonsdata kunne en forklare hvordan dette enzymet spesifikt kunne binde uracil i det aktive setet og hvordan de naturlig DNA basene ble ekskludert. En positivt ladd "kløft" i overflaten på enzymet ga et hint hvor DNA-dobbelheliksen ville binde for å komme inn i det aktive setet.

Uracil DNA-glykosylase inhibitoren Ugi er et lite protein som kodes av B. subtilis bakteriofagen PBS2. PBS2-genomet inneholder naturlig uracil, og Ugi hindrer at vertscellens UNG-protein ødelegger bakteriofagens genom. Krystallstrukturen av human UNG i kompleks med Ugi ble publisert samme år i Cell (Mol et al., 1995 B), og var også et resultat det sterke samarbeidet som hadde oppstått mellom gruppene til John Tainer og Hans Krokan. Ugi binder seg til UNG ved å etterlikne interaksjonen mellom DNA og UNG.

På grunnlag av krystallstrukturen av human UNG ble det designet mutanter av UNG som ga mindre selektive glykosylaser. Ved å bytte ut enten residuet asparagin 204 med aspartat eller tyrosine 147 med alanin, serin eller cystein oppnådde vi å få enzymer med aktivitet mot henholdsvis normal cytosin og tymin. Dette arbeidet ble publisert i EMBO J i 1996 (Kavli et al, 1996 ), og en av disse glykosylasene er nå patentert.

Krystallstrukturen av human UNG bundet til uracilholdig DNA ble publisert i Nature i 1996 (Slupphaug et al, 1996 ). Dette var den første strukturen av et eukaryotisk reparasjonsenzym bundet til skadet DNA. I denne studien ble det designet UNG-mutanter som hadde redusert katalytisk effektivitet og samtidig økt DNA-binding. Kompleksstrukturen viste at DNA binder i ei positivt ladet "kløft" på overflaten av UNG og at uracil blir flippet ut av DNA dobbel-heliksen og inn i det aktive setet til UNG. Dette etablerte "base-flipping" som et begrep innen DNA-reparasjon, og har senere blitt vist for flere andre DNA-glykosylaser. Utflippingen skjer ved at elektrostatiske interaksjoner mellom UNG og DNA fordreier ryggraden til den uracil-holdige DNA tråden, en leucin-holdig UNG loop trenger inn i DNA-heliksen og skyver uracil ut av heliksen. Komplementære omgivelser for uracil trekker basen inn i det aktive setet i riktig konformasjon for katalyse. Denne mekanismen blir referert til som "push-pull." Leucin okkuperer den tomme plassen i DNA heliksen og fungerer som en "dørstopper" for at uracil ikke skal flippes tilbake.

Forfatterne skriver følgende i Nature artikkelen fra 1996 :
"The versatility of nucleotide flipping as described here, and its likely conservation among eukaryotic and prokaryotic UDGs, indicate that this may be a widespread mechanism in DNA-base repair and modification processes, supports its early evolution, and suggest that nucleotide flipping could emerge as a major mechanism for enzyme recognition of nucleotides within nucleic acid polymers."

Denne hypotesen viste seg å holde mål. Mekanismene for gjenkjenning og utflipping av skadet base som ble beskrevet over vist seg å være generelle karakteristika for reparasjonsenzymer (Huffman et al., 2005 ).

I de påfølgende krystallstrukturene av UNG i kompleks med DNA som ble publisert i samarbeid med Professor John Tainer ble de mekanistiske detaljene rundt skadegjenkjenning, base flipping og katalyse videre studert. I EMBO J,1998 (Parikh et al, 1998 ) blir det først lanserte "push-pull" utvidet til "pinch-push-pull." Tre serin-prolin loopmotiv initierer reparasjon ved å binde og klemme på DNA ryggraden slik at denne fordreies og den skadde basen kan lettere flippes ut av DNA heliksen. På grunnlag av krystallstrukturene av human UNG, biokjemisk karakterisering og sekvenslikhet med UNG fra andre organismer ble fem viktige motiv som karakterisere UNG enzymet. I den påfølgende artikkelen publisert i PNAS ble UNG krystallisert sammen med DNA som holdt en uracil-analog, hvor den N-glykosidiske bindingen ikke ble kløyvd enzymatisk av UNG enzymet (Parikh et al, 2000 ). Kompleksstrukturen representerte derfor en intermediær tilstand i den enzymatiske reaksjonen, og ga verdifull innsikt hvordan energi fra DNA-substratet blir brukt av enzymet i den katalytiske reaksjonen.

I de siste årene har samarbeidet med Professor John Tainer i tillegg til å omfatte studier med UNG enzymet også blitt utvidet til andre reparasjonsproteiner som forskningsgruppen for DNA og genomstabilitet jobber med. Et spesielt interessant prosjekt har vært knyttet til struktur/funksjons karakterisering av de humane AlkB homologene (ABH). Et arbeid fra Krokans gruppe publisert i Nature i 2003 (Aas et al, 2003 ) viste at human ABH2 og 3 fjerner visse metylskader fra DNA og RNA (hABH3). Dette er en direkte reversering av skaden og den enzymatiske demetyleringen er avhengig av jern, 2-oxoglutarat og molekylært oksygen. Krystallstrukturen av human ABH3 homolog i kompleks med jern og 2-oxoglutarat ble publisert i 2006 i EMBO J (Sundheim et al, 2006 ). Ut fra den tredimensjonale strukturen fant vi flere viktige residuer ansvarlig for binding til DNA og spesifikt til den metylerte skaden som ikke tidligere har vært beskrevet, betydningen av disse residuene ble karakterisert i funksjonelle mutasjonsstudier. Strukturen viser videre at skadete baser sannsynligvis må flippes 180 grader for å binde i det aktive setet, slik første gang påvist hos UNG, og at et unikt hårnålstruktur-element er ansvarlig for flippingen. Ut fra krystallstrukturen kunne en se at et aktiv-sete leucin var modifisert. Modifikasjonen ble vha mutagenese og massespektrometriske metoder verifisert til å være oksidering av et side-kjede karbon. Vi viste også at oksideringen var et resultat av ukoblet dekarboksylering av enzymets kosubstrat, 2-oxoglutarat. Selv-hydroksyleringen resulterer i en inaktivering av enzymet, og er muligens en måte for enzymet å inaktivere seg selv irreversibelt.

Prosjekter fremover
Vi vil fortsette samarbeidet med Professor John A. Tainer i struktur/funksjons analyser av DNA reparasjons proteiner, og hvordan disse interagerer med skadet DNA/RNA og andre proteiner i ulike reparasjonsspor. Med anskaffelsen av eget røntgendiffraktometer, Xcalibur NOVA fra Oxford Diffraction, kan vi nå også samle røntgenkrystallografidata her i Trondheim. Fokuset fremover vil bli å fortsette struktur/funksjons karakterisering av de humane AlkB homologene. Av de 8 humane homologene som er kjent i dag er kun det katalytiske domenet av homolog 3 kjent (Sundheim et al, 2006). Vi vil også fortsette arbeidet med å karakterisere UNG enzymet, og her vil hovedfokuset ligge på å studere det N-terminale regulatoriske domenet. Ved hjelp av ulike teknikker har vår gruppe og andre vist at reparasjonsproteiner interagerer med hverandre, og mest sannsynlig eksisterer det dynamiske reparasjonskompleks som er i stand til fullføre et reparasjonsspor komplett. Vi vil bruke vår ekspertise på dette området og se på hvordan disse dynamiske kompleksene er bygd opp og regulert, og strukturanalyser av forenklede modeller av reparasjonskompleksene vha røntgenkrystallografi vil være en av teknikkene vi benytter til å studere disse.