Proteomikk

Ansvarlig: Professor Geir Slupphaug

Om laboratoriet
Proteomikklaboratoriet ved IKM er lokalisert i Laboratoriesenteret på nye St.Olav, i 4 etg. Driften er samfinansiert via FUGE II/FUGE Midt-Norge og av prosjekt innen DNA-reparasjonsgruppen. Fra 2008 er laboratoriet en node innen det Norske Proteomikkonsortiet NorProteomics, med hovedansvar for å yte tjenester innen proteomikkanalyse ved NTNU og Midt-Norge forøvrig. Dette omfatter protein identifikasjon, de-novo sekvensering, og analyse av posttranslasjonelle modifikasjoner.

Pr 2008 disponerer laboratoriet følgende utstyr:

• Bruker Ultraflex III MALDI TOF-TOF massespektrometer
• Applied Biosystems QStar (nano-ESI-QTOF) MS/MS massespektrometer in-line med Dionex nano-HPLC
• Applied Biosystems API 5000 lineær triple-quadrupol massespektrometer in-line med Schimazdu HPLC
• 2D-PAGE utstyr (IGPhor, Ettan)
• Ettan Spotpicker
• Typhoon Trio Laserskanner (f. eks til DIGE-analyser etter Cy 2/3/5-merking)

Videre finnes det en lang rekke utstyrsenheter tilgjengelig i de nærliggende lokalene ved IKM, og som benyttes til ulike komplementerende proteinanalyser. Dette omfatter laser-konfokalmikroskop, røntgendiffractometer (Oxford), lavtrykks-LC-utstyr for proteinseparasjon (Akta FPLC, Akta Explorer), Western geldokumentasjon (Kodak), beta-sctintillasjonsteller, sentrifuger med mer.

Tjenester:
Proteomikknoden er pålagt av NFR å generere inntekter som kan bidra til å sikre finansiering ut over FUGE II-perioden. Dette betyr at den enkelte forsker betaler for analysene utført ved laboratoriet. Det anbefales å legge inn et estimat over slike kostnader allerede under planlegging/søknad om nye prosjekter. Det utlyses også jevnlig midler fra FUGE Midt-Norge til kjøp av plattformtjenester.

Proteomikknoden kan tilby følgende tjenester:

• Identifikasjon av proteiner separert med 1D/2D-PAGE
• Identifikasjon av bestemte post-translasjonelle modifikasjoner (f. eks. fosforylering)
• De-novo sekvensering
• 2D-DIGE -analyse (Ved kapasitet)
• Opplæring i proteinidentifikasjon fra massespektrometrigenererte sekvensdata (i samarbeid med bioinformatikkplattformen, NTNU)

Priser:
Felles priser er under utarbeidelse for alle nodene innen proteomikkonsortiet. For foreløpige priser kan henvendelse skje til geir.slupphaug@ntnu.no.

Proteomikkstudier innen DNA-reparasjon
Alle former for kreft har sitt opphav i skader i DNA, og kontinuerlig reparasjon av arvematerialet er av fundamental betydning for beskyttelse av genomet. Forståelse av de grunnleggende molekylære mekanismene som regulerer human DNA-reparasjon kan derfor gi informasjon av betydning for

a) identifikasjon av individ med nedsatt DNA-reparasjonkapasitet
b) individuell behandling på bakgrunn av pasientens egen DNA-reparasjonskapasitet

Det er en klar sammenheng mellom svikt i flere DNA-reparasjonsspor, og ulike typer kreft. Dette gjelder nukleotide-eksisjons-reparasjon (NER), mismatch-reparasjon (MMR) og reparasjon av DNA-dobbelt-trådbrudd (DSB). Sammenhengen mellom kreft og nedsatt base-eksisjonsreparasjon (BER) er imidlertid mangelfullt kartlagt. Nye funn fra blant annet vår gruppe tyder imidlertid på at mangelfull BER av uracil har en sammenheng med hyperproliferasjon av B-celler og utvikling av kreft i lymfoide organ.

Vi kartlegger nå den molekylære reguleringen av BER ved proteomikk-baserte teknikker, med hovedvekt på regulering av dynamiske proteinkompleks i BER. BER er en langt mer komplisert prosess enn tidligere antatt, og i cellekjernen finnes alternativer av dette sporet som involverer helt ulike proteinkompleks . I alt er det nå funnet 15 humane enzymer og andre proteiner som er involvert i de skade-generelle trinnene (etter glykosylasetrinnet) i BER, og mange av disse er også involvert i DNA-replikasjon og transkripsjon. Dette indikerer at det foreligger en overordnet regulering av samspillet mellom de ulike prosessene. Det er også mye som tyder på at det foreligger dynamiske BER-kompleks, hvor skadestedet til enhver tid er beskyttet av flere BER-faktorer, og at påfølgende faktorer rekrutteres aktivt til komplekset. Dette er sannsynligvis avgjørende for å unngå cytotoksiske og mutagene effekter av DNA-reparasjonsintermediatene.

Vi isolerer nå funksjonelle BER-kompleks fra normale celler og tumorcellelinjer, som inneholder alle basale enzymaktiviteer nødventig for komplett BER, og karakteriserer komponentene ved 2D-PAGE/MALDI-TOF og LC-ESI-MS/MS massespektrometri. Spesielt undersøker vi hvordan spesifikke N-terminale fosforyleringer av den initielle glykosylasen UNG2 påvirker den nedstrøms BER-prosessen. Vi har nå identifisert 3 ulike cellesyklusregulerte S/T-fosfoformer av UNG2. Disse fosforyleringene regulerer enzymaktiviteten, interaksjon med proteiner i DNA-replikasjonsapparatet (PCNA og RPA), og enzymets levetid via ubiquitinylering (Hagen et al., EMBO J.2008).

Vi fortsetter også studiene av B-celler fra pasienter med HIGM-syndrom. Av spesiell interesse her er effekten av mutasjoner (bla. funnet i våre pasienter) på binding mellom UNG2 og RPA/AID (acivation induced deaminase) og mellom UNG2/PCNA. AID deaminerer normal DNA-cytosin til uracil i immunglobulin switch-regionene, og UNG2 fjerner deretter uracil og medierer DNA dobbeltrådbrudd for å muliggjøre klasseskift-rekombinering (CSR) under antistoffmodningen. Hvordan dette skjer, er imidlertid helt ukjent, og vi arbeider med å kartlegge involverte faktorer med immunpresipitering 2D-PAGE og massespektrometri (MALDI-MS og nano-LC-ESI-MS/MS).

Vi arbeider også intensivt med struktur/funksjonsstudier av de humane alkB-homologene hABH2 og 3, som fjerner metylskader fra DNA (og RNA) (Aas et al, Nature, 2003). Til disse studiene benytter vi en kombinasjon av røntgenkrystallografi og massespektrometri. Selve krystallstrukturen og beskrivelsen av modifikasjonen ble nylig publisert i EMBO Journal (Sundheim et al, 2006.).