Mikroskopi og flowcytometri

Utstyr:

1. Zeiss Axiovert 200M med bildebehandlingssystem (Invertert mikroskop).Gruppen disponerer et Axiovert 200 invertert fluoresensmikroskop fra Zeiss, med 10x EC PLan Neofluar og 20x, 40x, og 63x LD Plan Neofluar objektiver. LD Plan Neofluar (tørr) objektivene kan stilles inn slik at de korrigerer aberasjon for dekkglass fra 0-1,5mm tykkelse, og fungerer ypperlig for kontrastmetoder som fasekontrast, DIC og PlasDIC. For fluoresens er mikroskopet tilkoblet en HBO100 UV-lyskilde og har filtre for DAPI, Rhodamin og EGFP. Et robust og anvendelig fluoresensmikroskop. Mikroskopet kan styres direkte manuellt eller via Axiovision 4,4 programvare, som også styrer et AxioCam MrM for visualisering på skjerm eller billedtaging. Vi har også muligheter for å koble til et Sony XCD-X700 kamera som kommuniserer med Komet 5,5 programvaren fra Andor Technologies (tidligere Kinetic Imaging) for analyse av DNA skade på enkeltcellenivå (kometanalyse).
   Ansvarlig: Stipendiat Audun Hanssen-Bauer
2. LSM 510 Meta konfokal mikroskop invertert, m/DIC og fire lasere Diode laser 405 nm, Argon/2 laser 458/477/488/514 nm, HeNe laser 543 nm, HeNe laser 633nm, 10x og 20x M27 (tørr), 40x og 63x Oil DIC M27 objektiv.
   Ansvarlig: Professor Marit Otterlei
3. Flowcytometer og celle sorterer
   FACsAria Basic m/3 lasere (407 nm, 488 nm, 633 nm), ACDU enhet for sorterting i plater.
   Ansvarlig: Overingeniør Nina Beate Liabakk

Hva studerer vi?

De mest vanlige DNA-skadene i mammalske celler er spontane baseskader inkludert tap av baser (abasiske seter, AP-seter) i DNA- kjeden samt singeltråd-brudd (SSB). Disse skadene repareres via base eksisjons reparasjon (BER), singeltråd-brudds reparasjon (SSBR) og direkte reparasjon. BER initieres av en DNA glykosylase som fjerner den uønskede basen, og resten av BER-sporet utføres av en rekke proteiner som er felles uavhengig av den originale baseskaden. Et sentralt protein i BER og reparasjon av singeltrådbrudd er XRCC1. XRCC1 har ikke noen kjent enzym aktivitet, men interakterer med mange sentrale proteinene involvert i BER, og man tror derfor at XRCC1 kan ha en viktig funksjon i organiseringen av reparasjonskomplekser. Mammalske cellelinjer med mutasjoner i XRCC1 har økt genomisk ustabilitet (økt søster kromatid utbytting, kromatid brudd etc.) samt økt sensitivitet for enkelte DNA-skadende agens. Dette kan tyde på at disse cellen har dårligere reparasjon av baseskader, baseløse seter og singeltrådbrudd.

Ved DNA reparasjonsgruppen ved IKM har vi vist at XRCC1 er assosiert med replikasjonsmaskineriet i cellene og at XRCC1 binder direkte til replikasjonsproteinet PCNA (Fan et al. 2004, NAR). I 1999 (Otterlei et al. 1999, EMBO J) ble det for første gang publisert at en DNA glykosylase, Uracil-DNA–glykosylasen UNG2, kodet av UNG genet, var assosiert med replikasjon og var involvert i en post-replikativ BER som fjerner feilinkorporert uracil i DNA. Senere er flere glykosylaser vist og å være samlokalisert med replikasjon. Vi studere XRCC1 og BER mekanismer med særlig fokus på replikasjonskoblet reparasjon. Vi har vist at en av de oksydativ demetylasene, hABH2, som fjerner metyleringsskader på base direkte også er kolokalisert med replikasjonsmaskineriet (Aas et al. 2003, Nature). Nylig har vi identifisert et nytt PCNA interakterende motiv i dette proteinet, det har vi kallet APIM (Gilljam et al. 2009, J Cell Biol). APIM finnes også i mange andre andre protein som er viktig for DNA reparasjon og celle syklus kontroll.

Det finnes både pre-replikative og post-replikative reparasjonskomplekser som reparerer singeltrådbrudd, baseløse seter og base-skader / misinkorporerte baser. For å belyse mekanismene for dette studerer vi reparasjonskomplekser i ulike stadier av celle syklus.

En god forståelse av replikasjonskoblet reparasjon vil kunne hjelpe oss til å optimalisere effekten av cytostatikabehandling, ved for eksempel spesifikk inhibering av sentrale reparasjonsproteiner. For eksempel har vi nylig funnet at overutrykk av APIM peptidet sensitiviser mange ulike celle linjer for flere ulike cytostatika, og vi tror dette skyldes at peptidet inhiberer flere ulike reparasjon og cellesyclusprotein å utføre jobb sin (Gilljam et al. 2009, J Cell Biol)

Metoder vi bruker i vår forskning: Det finnes i dag mange ulike fluoreserende tagger (blå, grønn, gul, rød) som kan observeres i fluoresensmikroskop. Man kan bruke slike tagger til å lage fusjonsprotein med det aktuelle proteinet man ønsker å studere. For eksempel, XRCC1-YellowFluorescentProtein fusjonsproteinet kan visualiseres i levende celler i et fluoresensemikroskop. Slik kan man studere dannelsen av BER komplekser i levende celler etter introduksjon av DNA skadende agens. Ved å bruke andre tagger på andre protein, og ved å se mange proteiner sammen, kan man studere dynamikken i BER kompleksene gjennom cellesyklus og etter indusert DNA skade. Vi har etablert teknikker for å se på tre ulike proteiner på samme tid. Videre er det etablert teknikker for å analyser hvilke proteiner som interakterer med hverandre inne i cellene via ”Fluorescence Resonance Energi Transfer” (FRET) analyser. Vi bruker et Flowcytometer og cellesorter for å isolere cellene som uttrykker disse fluoreserende fusjonsproteinene.

Vi har også etablert flere cellelinjer som uttrykker reparasjons proteiner i fusjon med både en YFP og en FLAG tagg. FLAG taggen gjør det lettere å isolere kompleksene for direkte analyser ved hjelp av massespektroskopi (MS, Q-tof, se protemikksiden) siden bare et fåtall av proteinene som inngår i BER og SSBR er kjent. Analyser av disse funksjonelle kompleksene ved hjelp av MS vil derfor kunne gi oss informasjon om ”nye” protein som direkte eller indirekte er involvert i reparasjon. Kloning av nyidentifiserte proteiner med fluoreserende tagg, og studier av disse in vivo i konfokal mikroskop vil gi oss nyttig kunnskap om lokalisering, bindingspartnere og funksjon av disse proteinene.