Forskningsgruppe for DNA reparasjon og genomstabilitet

Professor I Hans E. Krokan 
Professor I Marit Otterlei 
Professor I Finn Drabløs 
Professor I Geir Slupphaug 
Professor II Ole Nørregaard Jensen (hovedstilling Odense)

Betydningen av DNA reparasjon
Arvematerialet skades kontinuerlig av ytre og indre faktorer. Mer enn 150 DNA reparasjonsproteiner er involvert i ulike mekanismer for DNA reparasjon, som omfatter minst 5 ulike multi-enzym mekanismer. I tillegg repareres enkelte skader ved en entrinnsprosess. Defekter i DNA reparasjon kan føre til utviklingsforstyrrelser, defekter i immunsystemet, kreft og tidlig aldring.

Mål og perspektiver for forskningsgruppe for genomstabilitet
Gruppens overordnete mål er å øke innsikten i hvordan arvematerialet holdes intakt ved DNA reparasjon og hvordan defekter i reparasjonsmekanismer kan forårsake kreft, samt betydningen av DNA reparasjonsenzymer for immunforsvaret.

Gruppen har arbeidet særlig mye på baseeksisjonsreparasjon (BER), men har også bidratt betydelig på andre områder. Innen BER har gruppen arbeidet mye med enzymet uracil-DNA glycosylase (UDG eller UNG) fra menneske og mus. Dette enzymet er viktig for å unngå mutasjoner som følge av deaminering av cytosin til uracil, og for fjerning av feilinkorporert uracil. Innen dette området har gruppen ytet viktige bidrag bl.a. i form av kloning av genet, regulering, samt røntgenkrystallografisk bestemmelse av protein-strukturen. Nyere forskning har også vist at enzymet er viktig i affinitetsmodning av antistoffer og såkalt "class switch" f.eks. fra IgM til IgG, IgA og IgE. Vi har også bidratt vesentlig til denne forskningen. I tillegg har forskningen gitt grunnlag for ekspansjon inn i andre områder av BER. Gruppen vil nå i større omfang konsentrere innsatsen om forskning som vil gi forståelse DNA reparasjon har i kreftforebyggelse, og om mutasjoner i DNA reparasjonsgener, eller forstyrret uttrykk forårsaker kreft. Forskningsgruppen arbeider også med reparasjon av alkyleringsskader (særlig unormale metyleringer) i DNA og RNA. På dette området har forskningsgruppen påvist nye DNA reparasjonsenzymer kalt hABH2 og hABH3, som er humane homologer av AlkB proteinet i E. coli. Målet er å forstå funksjonene til hABH2, hABH3, de tilsvarende musehomologene, samt andre AlkB homologer.

Konsekvenser av defekt DNA eksisjonsreparasjon
Ved defekt DNA reparasjon ses økt forekomst av kreft. Dette er best dokumentert ved såkalt mismatch reparasjon (MMR), nukleotid reparasjon (NER) og reparasjon av dobbelttrådbrudd ved homolog rekombinasjon (HR) eller ikke-homolog ende sammenbinding (NHEJ). Inntil nylig har man visst mindre om hvorvidt defekter i baseeksisjons-reparasjon (BER) er forbundet med økt risiko for kreftutvikling. Det begynner nå imidlertid å komme informasjon som tyder på at defekt BER definitivt er av betydning for kreftutvikling, men kanskje ikke i form av distinkte syndromer slik som for enkelte av de andre reparasjonsdefektene. Vår egen forskning på mus med defekt i Ung-genet (Ung -/-) viser at disse har ca. 20-ganger økt forekomst av lymfom, vesentlig B-cellelymfom. Totalt kjenner man ca. 150 gener som er involvert i DNA reparasjon, men man vet forholdsvis lite om mer enn 50% av disse og enda mindre om reguleringen av dem. Sannsynligvis er det reelle antallet reparasjonsgener minst dobbelt så stort, siden man har klarlagt funksjonen til mindre enn 50% av genene i det humane genomet.

Baseeksisjonsreparasjon (BER) og direkte basereparasjon – forskninggruppens hovedområder
BER er nå i ferd med å bli forstått i betydelig grad når det gjelder mekanisme og dette legger et godt grunnlag for å forstå medisinsk betydning. Man vet imidlertid fortsatt lite om reguleringen av de enkelte genene involvert og den overordnete reguleringen av DNA reparasjon. Vi er nå i en meget god posisjon i forhold til å yte vesentlige bidrag til regulering av DNA reparasjonen, som det skal gjøres rede for lenger ned. De skade-gjenkjennende enzymene i BER kalles DNA glycosylaser. Blant 12 kjente DNA glycosylaser gjenkjenner og fjerner 4 uracil. Disse er uracil-glycosylaser fra UNG-genet (kvantitativt dominerende), SMUG1, T(U)DG og MBD4. Den relative betydningen av disse er ikke kjent. Minst 4 andre DNA glycosylaser er involvert i reparasjon av oksidative skader på puriner og/eller pyrimidiner, mens bare en kjent glykosylase som fjerner alkyleringer er kjent. Til gjengjeld er det minst 2 andre mekanismer for reparasjon av alkyleringssakder kjent. De ulike reparasjonssporene krever oftest en rekke ulike proteiner. NER krever f.eks. ca. 30 ulike peptider.

BER kan skje ved såkalt "short patch reparasjon, SPR" eller "long patch reparasjon LPR". I begge tilfellene fjernes først basen ved en DNA glycosylase og det abasiske setet (AP-sete) kløyves ved en AP-endonuklease. Ved SPR fjernes deretter deoksyribosefosfat ved DNA polymerase ?, en nukleotid settes inn ved samme polymerase og tråden ligeres ved en ligase, antagelig DNA ligase III. Dette er hovedmekanismen for BER, men det inngår flere proteiner enn de som er nevnt her, bl.a. XRCC1, et rammeprotein som ikke har katalytisk funksjon, men som deltar i organiseringen av et BER kompleks. LPR bruker i stor grad proteiner som også er involvert i DNA replikasjon, bl.a. FEN1 (en "flap" endonuklease), DNA polymerase ? og DNA ligase I. Hittil har det meste av arbeidet med BER og andre reparasjonsspor konsentrert seg om å finne frem til mulige deltakere i reparasjonssporene. Det er imidlertid i ferd med å bli klarlagt at BER som prosess er komplisert regulert, dette gjelder forøvrig også andre reparasjonsspor. Ulike prosesser ser ut til å skje i bestemte subnuklære avdelinger, f.eks. replikasjonsfoci, noen prosesser er S-fase avhengig, andre ikke. Skade "senses" av ett system (som antagelig er forskjellig for ulike spor), dette fører til en mobilisering av reparasjonsproteiner fra et lagringssted til skadestedet, der proteinene (eventuelt etter modifisering ved f.eks. fosforylering) inngår i mange ulike interaksjoner som samlet medfører DNA reparasjon. Samtidig må det skje en koordinering med andre cellulære prosesser som andre DNA reparasjonsspor, cellesyklus-progresjon, transkripsjon og replikasjon. Vi er bare i begynnelsen av arbeidet med å forstå hvordan disse prosessene samordnes.

Direktereparasjon av alkyleringsskader
DNA og RNA kan skades av en rekke alkylerende forbindelser. Mange cytostatika er også alkylerende forbindelser som gir samme typer skade. Det dreier seg i hovedsak om metyleringsskader, men for cytostatika er kloroetylering av baser og kryssbindingsskader også viktige. Metyleringsskader reparareres både ved baseeksisjonsreparasjon og direkte demetylering, enten ved en metyltransferase (O6-metylguanin methyltransferase, MGMT), eller ved oksidativ demetylering ved hABH2 og hABH3. De sistnevnte enzymene krever 2-oksoglutarat (2-OG) og O2 som kofaktorer og reparerer 1-metyladenin og 3-metylcytosin i DNA. Nokså overraskende viser det seg at denne mekanismen også benyttes til reparasjon av tilsvarende skader i RNA. Disse studiene har åpnet nye perspektiver både for reparasjon av alkyleringsskader i cellen generelt og kan gi ny forståelse av hvordan alkylerende cytostatika virker.

 

Bioinformatikk
I bioinformatikken brukes metoder fra informatikk, matematikk og statistikk til å analysere molekylærbiologiske data, for eksempel fra mikromatriseforsøk eller proteomikk. Forskningsgruppen for Bioinformatikk er en del av den nasjonaleFUGE-plattformen for bioinformatikk , og gir forskningsbasert bistand til andre forskere og forskningsgrupper. Gruppens egen forskning fokuserer særlig på utvikling av nye metoder for analyse av genregulering, men gruppen er også involvert i analyse av mikromatrisedata, studier av genvariasjon og strukturanalyse av biologiske makromolekyler, inkludert legemiddeldesign.

 

Tøndel og Drabløs, Letters in Drug Design & Discovery, 2, 507-515 (2005)

Letters in Drug Design & Discovery

 

Uttrykket av gener er blant annet regulert gjennom to viktige mekanismer, binding av transkripsjonsfaktorer og interaksjon med korte RNA-fragmenter. Transkripsjonsfaktorer er proteiner som gjenkjenner korte DNA-motiver i genomet. De binder til motiver som er assosiert med spesifikke gener, og bidrar til å regulere genuttrykket opp eller ned. Dette skjer gjennom et komplekst samspill av mange transkripsjonsfaktorer, og detaljene i dette samspillet er fortsatt dårlig forstått. Vi utvikler bedre metoder for å identifisere bindingsseter, med fokus på det humane genom. Vi har også laget forbedrede strategier for å teste nye metoder.

RNA-basert regulering (RNA interferens) ble oppdaget forholdsvis nylig, sammenlignet med transkripsjonsfaktor-basert regulering, og oppdagerne ble belønnet med Nobelprisen i medisin i 2006 . Det er fortsatt mye som ikke er kartlagt med hensyn til hvordan denne reguleringsmekanismen fungerer. Vi arbeider med utvikling av bedre metoder for identifikasjon av mikro-RNA gener i genomet, og kartlegging av mulige målområder for RNA fragmentene.

Viktige deler av forskningen skjer i nært samarbeid med bioinformatikk-firmaetInteragon AS . Forskningsgruppen har også tett samarbeid med Institutt for datateknikk og informasjonsvitenskap, forskningsgrupper ved Universitetet i Bergen og internasjonale forskningsgrupper. 

Forskerutdanning
Forskningsgruppen veileder for tiden 12 stipendiater og 7 postdoktorer. Forskningsgruppen har siden 1992 ført 13 kandidater from til doktorgrad. Noen av disse har tatt dr.ing. eller dr.scient. og derfor formelt blitt kreditert andre fakulteter ved NTNU. Faggruppen har veiledet over 30 kandidater frem til cand.scient., siv.ing. eller mastergrad.